观点

导语：

在生物工艺领域，微生物表达系统始终是生物药研发与生产的核心平台。尤其随着近年ADC（抗体偶联药物）、GLP-1减重治疗、细胞免疫治疗等成为大热赛道，微生物平台其本身也在经历革命性蜕变。

近期，药明生物副总裁，微生物产业化平台负责人张胜博士（Sam Zhang），在权威行业媒体Genetic Engineering & Biotechnology News (GEN)发表专题文章，重点剖析新型微生物表达系统的核心技术原理，深入解析药明生物新型大肠杆菌表达系统EffiX^TM如何突破传统工艺瓶颈，为创新生物制品从实验室研发到工业化生产的全链条提供关键支撑。

通过分享实际应用案例，文章展现了EffiX^TM表达系统在提升生物制品产量、收率、纯度、稳定性、安全性及生产连续性上的具体成效，能够加速生物药商业化成功。

点击此处，查看张胜博士专题文章英文原文。

当前，微生物表达系统（如大肠杆菌、酵母菌）在创新生物药领域发挥着前所未有的关键作用。包括ADC、细胞疗法、降糖/减重药物等在内的多种前沿创新疗法，以及VHH（纳米抗体）、酶、细胞因子、生长激素、多肽、VLP（病毒样颗粒)等新兴生物药领域均会用到微生物表达系统¹。

通过微生物系统表达蛋白,不仅成本低、周期短，且宿主遗传信息明确，易于实现规模化生产²。

但在工艺开发与GMP生产阶段，传统微生物表达系统也面临一系列挑战，包括遗传与表达稳定性不足、渗漏表达、毒性副产物（如乙酸）生成、翻译后修饰（PTM）欠佳，以及包涵体形成和中间体不稳定等问题。这些问题均可能导致产量下降和/或产品质量降低。

药明生物自研的创新型大肠杆菌表达系统EffiX^TM，能解决生物药CMC过程中的一系列挑战。结合工艺开发与生产环节的优化，该表达系统能够助力生物制药企业实现稳定、高收率、高质量的生物药生产，且具备显著的成本效益。

新型菌株与质粒设计

EffiX^TM表达系统通过优化质粒复制、靶基因转录、翻译及安全性实现技术升级。这为新型生物药，特别是那些难表达的复杂分子的稳定性和规模化生产奠定了坚实的基础。

图1：在产量、安全性、稳定性及纯度方面，EffiX^TM均优于于传统微生物系统。

(A) EffiX^TM是一个基于菌株与质粒工程技术的微生物表达平台；

(B)在无筛选压力的条件下，EffiX^TM可在120次倍增后仍维持稳定表达；

(C) 通过精密控制转录，EffiX^TM可实现产量2到5倍的提升；

(D)EffiX^TM能显著提高目标蛋白纯度（最高可达99%）；

(E)通过阻断噬菌体感染通路，EffiX^TM对T1/T5噬菌体及溶源性噬菌体表现出抗性。

• 可靠的遗传与表达稳定性

EffiX^TM表达系统（图1A）优化了质粒复制，可在不添加抗生素的条件下维持至少120次倍增传代。与此同时，目标蛋白实现稳定表达（图1B），质粒保留率达100%。作为质粒表达的替代方案，基因组整合表达则展现出更优的稳定性，且表达水平与质粒表达相当。而将上述方法联合使用，不仅能实现多种功能模块的共表达，支持非天然氨基酸掺入重组蛋白表达等复杂系统的构建，还能实现稳定生产，并最小化环境影响。

• 严格调控转录实现低基础表达

通过严格调控靶基因的转录，可有效解决传统BL21(DE3)-pET系统（业内常用的大肠杆菌表达载体系统）中常见的基础（渗漏）表达问题。借助质粒工程技术，可在诱导前严密抑制靶基因的转录，从而减轻代谢负荷。结果表明，工程菌株得以进入最佳的诱导后生长阶段，目标分子的产量可提高2至5倍（图1C）。

• 去除非预期PTM提高纯度

对于传统的BL21(DE3)-pET系统，尤其是在高细胞密度发酵中，目标蛋白容易发生翻译后修饰（PTM）。这些修饰变体在下游纯化环节难以去除，会影响最终产品的纯度。我们的方案是，通过改造翻译后修饰途径来消除非预期修饰变体，从而实现最终产品的高纯度（图1D）。

• 阻断感染途径实现噬菌体抗性

T1/T5 噬菌体感染可导致细胞裂解，从而造成产量下降。我们通过移除宿主菌株中原有的噬菌体受体，消除菌株对T1/T5噬菌体的易感性。此外，针对在广泛使用的BL21(DE3)菌株中常见溶原性噬菌体复活的风险，我们使用的宿主菌株经过工程化改造，可最大限度降低这种风险。这一改变，既保障了大规模生产，也能节省清除噬菌体污染所消耗的人力物力和时间（图1E）。

• 难表达蛋白的应对策略

针对难表达蛋白，药明生物构建了一整套“工具箱（解决方案）”，覆盖复制子、启动子、操作子、核糖体结合位点、信号肽、密码子优化算法、可切割纯化标签和分子伴侣等。该“工具箱”可精确调节转录强度和翻译效率，结合高通量筛选平台，能够成功表达95%以上的难表达蛋白。

发酵工艺优化

图2：创新生物药高细胞密度发酵工艺的开发流程。

(A)药明生物微生物发酵平台由先进的工艺开发监控与建模工具赋能。

(B)提升VHH产量的两阶段策略。

(C)产量提升案例：VHH生产效率提高约12倍。

(D)分泌性能提升案例：可溶性VHH分泌量提升约5倍。

• 稳健的高细胞密度发酵工艺

过程分析技术（PAT）是质量源于设计（Quality-by-Design, QbD）的核心（图2A），可实时监测所有关键工艺变量。而工艺建模，特别是基于实验设计（DoE）的方法，在工艺优化与表征中起着关键作用。DoE能够系统性地探索设计空间，精准识别关键参数的最优条件。在确定关键参数后，我们通过在平行生物反应器中进行高通量筛选验证，并进一步确认模型对放大生产、产量及质量的预测准确性，最终成功建立了稳健的高细胞密度发酵工艺，在保证产品质量的同时显著提升生产效率。

• VHH生产的微生物解决方案

在所有创新生物药中，VHH凭借分子体积小、溶解度高及优异热稳定性等独特特性，备受行业关注。但由于自身存在保守二硫键，VHH在大肠杆菌胞内表达时容易形成包涵体。为解决这一难题，药明生物使用EffiX^TM表达系统进行VHH表达，并对诱导时菌体浓度、诱导剂浓度、补料速率、温度等关键工艺参数进行了系统评估与优化。最终成功建立了一种显著增强蛋白质转运和分泌的两阶段高细胞密度发酵工艺（图2B）。该工艺具有独特的可溶性VHH释放途径——程序性细胞裂解与靶向产物释放，能有效简化下游纯化步骤。如图2C和图2D所示案例，相较于基准工艺，该技术使目标产物产量提升达12倍， VHH蛋白分泌效率增加5倍。​

覆盖多种分子类型的纯化技术

下游纯化作为微生物工艺的关键环节，面临着生物药日益多样化和复杂化带来的额外挑战³。常见的技术瓶颈包括：产量低、残留杂质高、中间体稳定性差、复性效率低，且缺少通用型解决方案。过去数年，药明生物针对性地开发了一套高度灵活的下游纯化技术，可精准适配细胞裂解、澄清、包涵体复性及层析纯化等单元操作。

图3：His-SUMO标签助力难表达蛋白的表达与纯化。

(A)即插即用型His-SUMO标签解决方案示意图。

(B)His-SUMO 标签促进难表达蛋白溶解及正确折叠示意图。

• 独特的His-SUMO标签解决方案

在大肠杆菌中表达的重组蛋白，其N端甲硫氨酸残基常存在异质性。这一现象可能导致特定情况下生物活性降低，还会对N端修饰、偶联等特定应用造成阻碍。通过在蛋白N端引入His-SUMO标签可有效降低这种异质性（图3）。此外，添加His-SUMO标签可以提高原本难以表达的目标蛋白的溶解性，进而规避包涵体复性的技术难题。经固定化金属离子亲和层析（IMAC）纯化，可实现大于95%的纯度。之后，His-SUMO标签经SUMO蛋白酶切割和流穿模式IMAC去除，再进一步精纯即可获得高纯度无标签蛋白。

• 包涵体复性平台

在某些情况下，包涵体复性难以避免。目前最常用的方法是稀释复性，但该方法通常会产生大体积的中间品。另一种更具技术挑战性的方案是柱上复性，可以有效强化下游工艺效率。需要注意的是，复性条件对目标分子具有高度特异性，且正确折叠蛋白的产率通常较低。我们利用专有缓冲液数据库进行高通量（HTP）筛选，有助于快速确认最佳复性条件，提高收率。在最近的一个案例研究中，柱上复性效率较基准条件提高60%，并成功完成大规模GMP生产。

GMP规模放大、可重复性与灵活性

图4：药明生物在GMP生产规模上具备稳健的工艺放大能力、优异的可重现性及灵活性。

(A)微生物工艺开发与GMP生产中发酵规模的灵活性。

(B)微生物发酵工艺放大的核心考量。

(C)稳健放大至GMP厂房及批次间性能一致性的案例研究。

• 稳健规模放大与优异重复性

为确保从工艺开发实验室到 GMP 生产的规模放大顺利落地及批次间一致性，我们开发了新型规模放大模型。该模型整合了氧传递速率、混合效率/均一性、传热系数及单位体积功率输入（P/V）等关键工程参数⁴。这些模型通过全面的工艺表征和实时过程监控得到进一步验证，实现了从工艺开发实验室到GMP厂房的无缝衔接（图4）。

• 微生物GMP生产规模的灵活性

由于各类生物药市场需求的差异性，不同生物药物的临床/商业批次生产规模可能有所不同。为满足生产规模的动态需求，我们建立了一个灵活的微生物平台，该平台配置了各类的生物反应器（30L–15000L 生产规模），搭配兼容的下游纯化生产线可高效支持 GMP 生产。

结论：

综上所述，通过攻克菌株特异性瓶颈、运用工艺开发的全维度工具包，以及在规模化放大中筑牢工艺稳健性，生物药开发者能充分激活微生物表达系统的潜力，实现经济高效生产的同时确保产品质量。药明生物微生物CMC平台，搭配灵活的GMP生产设施，微生物生产将更具适应性、可放大性、可重复性与成本可控性。

充分释放基于微生物表达平台的生物药的潜力，药明生物为ADC、细胞治疗等先进疗法铺就更通畅的落地路径，造福全球患者。

参考文献：

1.McElwain L, et al. Current trends in biopharmaceuticals production in Escherichia coli. Biotechnol Lett. 2022;44:917-931.

2.İbrahim I, Kaplan O. Escherichia coli in the production of biopharmaceuticals. Biotechnol Appl Biochem. 2025;72:528-541.

3.Bhatwa A, et al. Challenges associated with the formation of recombinant protein inclusion bodies in Escherichia coli and strategies to address them for industrial applications. Front Bioeng Biotechnol. 2021;9630551.

4.Junker BH. Scale-up methodologies for Escherichia coli and yeast fermentation processes. J Biosci Bioeng. 2004;97:347-364.