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范例分析:在大肠杆菌中表达可用作结构分析的CYP-X蛋白

背景

客户要求从基因序列开始生产CYP-X蛋白并用纯化后的蛋白长晶体来做结构分析。

挑战

  • 该蛋白表达水平非常低(小于0.5 mg/L)。
  • 该蛋白的溶解度很低。
  • 该蛋白目前的状态不利于结晶化。

解决方案/结果

  • 药明生物尝试了不同的大肠杆菌菌株以及多种表达载体组合来优化该蛋白的表达,同时还在培养基里加入了微量元素来提高产量。
  • 项目组在纯化过程中使用高盐裂解缓冲液,并使用了弱阳离子柱来优化纯化工艺。
  • 通过这些努力,项目组成功使该蛋白的表达从小于0.5mg/L提高到了15mg/L,并且用表达出的蛋白获得了高质量的衍射晶体,成功运用在了结构分析中。

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范例分析:纯度可超过95%的IgM生产

背景

客户要求生产95%以上纯度的IgM (通过SDS-PAGE和HPLC检测)。

挑战

  • 由于该蛋白分子量很大,导致它与原有的纯化填料结合力很低而且流速很慢。
  • 该蛋白的低溶解度和极端PH下容易变性的特点也决定了它无法使用传统的亲和柱纯化。

解决方案/结果

  • 药明生物的项目组在查阅了大量的文献后决定采用一种新方法来进行对流传质。
  • 同时结合在大分子蛋白生产上积累的丰富经验,项目组提出了一种新的三步柱纯化方案。
  • 最终成功实现了在短短六周内就交付了200mg完整表征的纯度97%的IgM。

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范例分析:用杆状病毒感染的昆虫细胞表达系统来生产激酶-Y

背景

客户要求生产高纯度的激酶-Y。

挑战

  • 该蛋白在大肠杆菌里是作为包涵体表达的。
  • 客户曾在他们自己的昆虫细胞里尝试过表达,结果产量非常低。
  • 由于旧有的纯化方法需要多个柱子,纯化时间的过长也导致了纯度和蛋白降解。

解决方案/结果

  • 药明生物项目组首先把杆状病毒的滴度成功提高到了108 pfu/ml。
  • 并且通过不同的MOI和时间点的尝试进一步优化了表达量。
  • 继而通过分子筛和亲和柱优化了纯化工艺。
  • • 最终项目组成功从1.6L的培养体系中交付了25mg纯度高于95%的激酶-K。

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范例分析:采用不同的抗体筛选平台获得种型特异性抗体

背景

  • 靶标蛋白有两个亚型,两个亚型之间区别很小。
  • 我们已经找到一些针对亚型1的功能抗体,并且从杂交瘤技术中获得了很多同时结合亚型1和亚型2的功能抗体。

挑战

经过多次免疫,始终没有得到特异性针对亚型2的功能抗体。

解决方案/结果

通过对我们自主构建的人天然噬菌体库进行筛选,我们可以只用一次战役就获得亚型2特异性的功能抗体,总结见右图。

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范例分析:从药明生物自主构建的全人天然抗体噬菌体库中筛选抗体药物

背景

用药明生物自己建立的全人天然抗体库中获得特异性识别抗原1的两个剪接异变体1a和1b的抗体。

挑战

  • 靶标抗原有两个剪接体(1a和1b),之间区别大于20个氨基酸。
  • 杂交瘤技术不能得到选择性识别1b抗原的抗体。

解决方案/结果

用抗原1b作为筛选目标,同时加入抗原1a作为竞争剂,从人天然抗体噬菌体库中筛选抗体,用单克隆抗体噬菌体ELISA检测第二轮和第三轮的产物, 寻找特异性结合的抗体噬菌体。筛选中我们发现,第三轮的产物中抗原1b特异性的抗体获得富集,而抗原1a和1b的交叉结合抗体相应减少。序列分析第三轮的阳性克隆,得到6个不同序列的抗体株,其中2个和细胞表面表达的抗原1b有非常强的结合 (数据未显示)。

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范例分析: 用亲和力成熟获得Kd值在皮摩尔级别的抗体

背景

要求对客户的鼠单克隆抗体进行亲和力成熟并人源化。

挑战

母本抗体的亲和力约1nM,需要提高亲和力到几十pM,以达到与对照抗体亲和力接近或者更高。

解决方案/结果

  • 我们利用两个方法提高抗体亲和力:

1. 吝啬突变(Parsimonious mutagenesis)重链的CDR3区
2.对轻重链进行随机突变

  • 吝啬突变(Parsimonious mutagenesis) 将亲和力提高10倍
  • 随后进行随机突变,得到5个亲和力提高的克隆
  • 最后选择了一个克隆,具有皮摩尔级别的亲和力,优于对照抗体。

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